Test de hibridizare in situ: ce este, cand e recomandat

Ce este testul de hibridizare in situ?

Testul de hibridizare in situ (FISH - Fluorescence In Situ Hybridization) (1) este o tehnica utilizata pentru detectarea si localizarea unor secvente specifice de ADN sau ARN in celule sau tesuturi. Aceasta metoda implica utilizarea unor sonde de ADN sau ARN marcate cu fluorofori (molecule fluorescente), care se leaga in mod specific de secventele tinta printr-un proces numit hibridizare.

Hibridizarea in situ a fost introdusa in anii 1960, iar primele aplicatii au fost limitate la studii de baza. Dezvoltarea metodelor fluorescente in anii 1980 a revolutionat domeniul, facand posibila detectarea rapida si precisa a mutatiilor genetice.

Tipuri de hibridizare in situ

Hibridizarea in situ este o tehnica versatila utilizata pentru detectarea secventelor specifice de ADN sau ARN in celule sau tesuturi. In functie de scopul si metodologia aplicata, exista mai multe tipuri de hibridizare in situ, fiecare avand caracteristici distincte. Iata principalele tipuri si detalii despre fiecare (1), (2):

Hibridizare in situ fluorescenta (FISH - Fluorescence In Situ Hybridization)

Utilizeaza sonde de ADN sau ARN marcate cu fluorofori, care emit lumina fluorescenza la expunerea la o anumita lungime de unda.

Hibridizarea in situ fluorescenta este folosita pentru detectarea aberatiilor cromozomiale (deletii, duplicatii, translocatii), analiza expresiei genelor in cancer (ex.: amplificarea genei HER2 in cancerul de san), diagnosticul prenatal pentru identificarea anomaliilor cromozomiale (ex.: trisomiile).

Permite detectie rapida si specifica, posibilitatea de a vizualiza celulele in diferite stadii (diviziune sau interfaza). Are sensibilitate scazuta pentru mutatii mici sau subtile si necesita echipamente avansate, cum ar fi microscopul fluorescent.

Hibridizare in situ cu cromogen (CISH - Chromogenic In Situ Hybridization)

Utilizeaza sonde marcate cu molecule cromogene, care produc un semnal vizibil la microscopul optic. Hibridizarea in situ cu cromogen este folosita la detectarea anomaliilor genice sau cromozomiale, similar FISH si la analiza amplificarii genice in cancer (ex.: HER2).

Este frecvent utilizata ca alternativa mai accesibila la FISH si poate fi realizata cu microscop optic standard. Rezultatele pot fi stocate pe termen lung sub forma de lame permanente. Semnalele cromogene pot avea rezolutie mai mica decat cele fluorescente, iar procesul poate fi mai lent decat FISH.

Hibridizare in situ pentru ARN (RNA-ISH)

Este specifica pentru detectarea moleculelor de ARN mesager (ARNm) sau ARN necodificator (ARNnc) in celule sau tesuturi. Hibridizarea in situ pentru ARN este folosita pentru analiza expresiei genice, studierea transcriptomului la nivel celular si cercetarea bolilor virale prin detectarea ARN-ului viral in probe.

Are sensibilitate ridicata pentru moleculele de ARN si permite analiza spatiala a expresiei genice in tesuturi. La hibridizarea in situ pentru ARN, moleculele de ARN sunt mai fragile si pot necesita conditii stricte de manipulare.

Hibridizare in situ pe tesuturi intregi (Whole Mount In Situ Hybridization)

Este utilizata in special in cercetarea dezvoltarii organismelor. Hibridizarea in situ pe tesuturi intregi este folosita la studiul expresiei genice in etapele timpurii ale dezvoltarii embrionare si la cercetarea modelarii spatial-temporale a genelor.

Hibridizarea in situ pe tesuturi intregi ofera o imagine globala a expresiei genelor intr-un organism sau tesut. Este o tehnica laborioasa si necesita experienta semnificativa.

Hibridizare genomica comparativa in situ (CGH - Comparative Genomic Hybridization)

Permite compararea ADN-ului unui pacient cu un ADN de referinta, utilizand sonde diferit marcate. Hibridizarea genomica comparativa in situ este folosita pentru detectarea dezechilibrelor genomice (deletii, duplicatii, amplificari) si analiza detaliata a anomaliilor cromozomiale in cancer.

Permite o detectie precisa a dezechilibrelor cromozomiale si analiza simultana a intregului genom. Nu poate detecta translocatiile echilibrate sau mutatiile punctiforme.

Hibridizare in situ cuantificabila (Q-FISH - Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization)

Reprezinta o varianta avansata a FISH, care permite cuantificarea semnalelor fluorescente. Hibridizarea in situ cuantificabila permite masurarea lungimii telomerilor si detectarea nivelului de expresie genica specifica.

De asemenea, permite analiza cantitativa a modificarilor genetice si are sensibilitate ridicata pentru semnalele slabe. Hibridizarea in situ cuantificabila necesita un software avansat pentru analiza datelor.

Hibridizare in situ pe microarray (Array-based In Situ Hybridization)

Combina tehnica de hibridizare cu microarray-uri pentru a analiza expresia genelor sau anomaliile genetice la scara larga. Hibridizarea in situ pe microarray se utilizeaza pentru profilarea expresiei genice in diferite conditii experimentale si analiza comparativa a genomului intre indivizi.

Asigura o capacitate mare de analiza simultana a numeroase gene si informatii complexe despre expresia globala a genelor. Implica costuri ridicate si cerinte tehnice avansate.

Hibridizare in situ pe baza de inalta rezolutie (High-Resolution In Situ Hybridization)

Utilizeaza metode imbunatatite pentru a oferi imagini de inalta rezolutie a semnalelor de hibridizare. Hibridizarea in situ pe baza de inalta rezolutie este folosita pentru analiza detaliata a organizarii cromozomilor si genelor, la cercetarea expresiei genice in structuri celulare complexe.

Ofera detalii fine despre structura si localizarea genelor si este un test recomandat pentru cercetari avansate. Necesita echipamente speciale, cum ar fi microscoapele confocale.

Cand este recomandat testul de hibridizare in situ (FISH)?

Testul de hibridizare in situ este recomandat in urmatoarele situatii (2):

Diagnostic oncologic

Testul de hibridizare in situ este utilizat pentru detectarea amplificarii genelor sau a mutatiilor specifice implicate in dezvoltarea unor tipuri de cancer, cum ar fi cancerul de san (HER2), cancerul pulmonar (ALK, ROS1) sau alte tipuri de tumori. Determinarea statusului HER2 in cancerul de san este unul dintre cele mai comune exemple de utilizare a tehnicii FISH (hibridizare fluorescenta in situ).

Detectarea infectiilor virale

Testul de hibridizare in situ este folosit la identificarea genomului viral in tesuturi, de exemplu, in infectiile cu HPV (virusul papiloma uman) asociate cancerului de col uterin sau alte infectii virale (citomegalovirus, virus Epstein-Barr).

Investigatii genetice

Testul de hibridizare in situ este folosit in diagnosticul bolilor genetice prin detectarea deletiei, amplificarii sau translocatiilor cromozomiale specifice.

Identificarea translocatiilor cromozomiale 

Testul de hibridizare in situ este utilizat in analiza anomaliilor cromozomiale in leucemii si limfoame (ex.: translocatia BCR-ABL in leucemia mieloida cronica).

Studiul expresiei genelor 

In cercetare, testul de hibridizare in situ este folosit pentru a analiza nivelul de expresie al genelor specifice intr-un tesut sau celule.

Diagnostic prenatal

Testul de hibridizare in situ contribuie la detectarea unor anomalii cromozomiale sau genetice la fat.

Evaluarea prognosticului

Testul de hibridizare in situ ajuta la determinarea markerilor genetici asociati cu raspunsul la tratament sau cu evolutia bolii (de exemplu teste predictive pentru terapii targetate).

Rezultatele si interpretarea testului de hibridizare in situ

Rezultatele si interpretarea testului de hibridizare in situ (ISH) (2), (3) depind de tipul testului utilizat (FISH - fluorescenta sau CISH - cromogenica) si de scopul specific al analizei. Interpretarea este realizata de specialisti in patologie moleculara, iar urmatoarele puncte rezuma aspectele esentiale:

Rezultatele posibile

• pozitiv - indica prezenta mutatiilor, amplificarilor genice, translocatiilor sau altor anomalii genetice in celulele analizate;
• negativ - nu s-a detectat nicio anomalie genetica tinta in probele analizate;
• rezultat ambiguu/neconcludent - semnalele obtinute nu permit o interpretare clara.

Poate fi necesara repetarea testului sau utilizarea unei metode alternative.

Interpretarea rezultatelor

Interpretarea depinde de contextul clinic si de tipul cancerului investigat:

Cancer de san (HER2)

• pozitiv: amplificare HER2 (mai mult de 6 copii ale genei HER2 sau un raport HER2/CEP17 > 2.0). Pacienta poate beneficia de terapie targetata (ex.: trastuzumab);
• negativ: fara amplificare HER2 (mai putin de 4 copii ale genei HER2 sau raport < 1.8).

Cancer pulmonar (ALK/ROS1)

• pozitiv: prezenta rearanjamentului ALK sau ROS1 indica eligibilitate pentru terapii cu inhibitori de tirozin-kinaza.
• negativ: fara translocatii detectabile; alte optiuni terapeutice pot fi luate in considerare.

Leucemii si limfoame

Detectarea translocatiilor cromozomiale (ex.: BCR-ABL, MYC) confirma diagnosticul specific si poate ghida tratamentul.

Infectii virale

Detectarea ADN-ului viral (ex.: HPV, EBV) indica prezenta unei infectii asociate cu tumori specifice.

Rezultatele trebuie intotdeauna integrate cu datele clinice si histopatologice ale pacientului (3). Testul ISH este un instrument esential pentru diagnostic si tratament personalizat, iar interpretarea corecta sta la baza deciziilor terapeutice optime.

Acest articol are un rol strict informativ, iar informatiile prezentate nu inlocuiesc controlul si diagnosticul de specialitate. Daca te confrunti cu simptome neplacute, adreseaza-te cat mai curand unui medic. Numai specialistul este in masura sa iti evalueze starea de sanatate si sa recomande testele necesare sau masurile de tratament adecvate pentru ameliorarea simptomelor! 

Bibliografie: 

1.pmc.ncbi.nlm.nih.gov „Recent Advances in High-sensitivity In Situ Hybridization and Costs and Benefits to Consider When Employing These Methods” https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10323200/ (accesat la 15.11.2024)

2.researchgate.net „Fluorescence in situ hybridization (FISH): types and application: a review” https://www.researchgate.net/publication/372479462_Fluorescence_in_situ_hybridization_FISH_types_and_application_a_review_Article_Informations (accesat la 15.11.2024)

3.news-medical.net „Applications of FISH” https://www.news-medical.net/life-sciences/Applications-of-FISH.aspx (accesat la 15.11.2024)