Teste de imunohistochimie: ce sunt, cand se recomanda

Ce sunt testele de imunohistochimie?

Imunohistochimia (1) se bazeaza pe utilizarea anticorpilor specifici, care sunt molecule ce recunosc si se leaga de o anumita proteina (antigen) dintr-un tesut. Dupa legarea anticorpului, se folosesc markeri vizuali (enzime, coloranti sau fluorescente) pentru a observa si analiza prezenta sau absenta proteinei tinta.

Testele IHC sunt efectuate pe sectiuni subtiri de tesut care au fost fixate si pregatite pe lame de microscop. Rezultatul permite evidentierea proteinelor specifice in contextul arhitecturii tesutului.

Cand se recomanda testele de imunohistochimie?

Aceste teste sunt indicate intr-o varietate de situatii medicale, inclusiv (1), (2):

Diagnosticul si clasificarea tumorilor

Testele de imunohistochimie sunt utilizate pentru identificarea naturii tumorilor si pot diferentia tumorile benigne de cele maligne. Testele IHC sunt utile in determinarea originii tumorilor metastatice, deoarece pot identifica tesutul sau organul de unde a pornit o tumora metastatica. Sunt folosite in clasificarea tumorilor pe subtipuri: de exemplu, in cazul carcinomului, limfomului sau melanomului.

Evaluarea prognosticului si alegerea tratamentului

Testele de imunohistochimie sunt utilizate pentru evaluarea prognosticului medical. Markerii precum Ki-67 (indicele de proliferare celulara) ofera informatii despre agresivitatea tumorii (1).

De asemenea, testele IHC sunt utilizate pentru a determina daca o tumora exprima anumiti receptori sau proteine care pot fi tintite terapeutic (1):

• HER2 in cancerul de san;
• receptorii de estrogen si progesteron in cancerul de san;
• PD-L1 in terapia imunologica a diferitelor tipuri de cancer.

Diagnosticul bolilor infectioase

Testele IHC sunt utilizate pentru detectarea unor agenti patogeni (virusuri, bacterii, fungi) in tesuturi, folosind anticorpi specifici pentru proteinele acestora (2).

Boli inflamatorii si autoimune

Testele de imunohistochimie contribuie la evidentierea anumitor markeri implicati in inflamatie sau in procese autoimune, pentru a sustine diagnosticul unor afectiuni cronice.

Cum se efectueaza testele de imunohistochimie?

Testele de imunohistochimie (IHC) sunt tehnici utilizate in biologia moleculara si patologie pentru a detecta prezenta si localizarea unor proteine specifice intr-o sectiune de tesut. Aceste teste se bazeaza pe interactiunea dintre un anticorp specific si antigenul tinta. Iata un ghid detaliat despre cum se efectueaza testele IHC (1):

Pregatirea probei

Tesutul este prelevat prin biopsie sau interventie chirurgicala. Proba trebuie fixata imediat pentru a preveni degradarea. Fixarea se face de obicei in formalina tamponata neutrala.

Tesutul fixat este deshidratat printr-o serie de solutii de etanol si inclus in parafina pentru a facilita sectionarea. Blocul de parafina este taiat in sectiuni subtiri (de obicei 4-5 micrometri) folosind un microtom. Sectiunile sunt apoi montate pe lame de sticla tratate pentru a preveni detasarea in timpul procesului.

Deparafinarea si rehidratarea sectiunilor

Sectiunile de tesut sunt trecute printr-o serie de bai cu xilen pentru a elimina parafina. Urmeaza rehidratarea progresiva in solutii de etanol cu concentratie descrescatoare (de la 100% la 70%), urmata de clatirea in apa distilata.

Recuperarea antigenica

Fixarea in formalina poate masca epitopii antigenelor, astfel ca este necesara recuperarea antigenica.

Recuperarea se face fie prin:

• metoda caldurii: sectiunile sunt incalzite in solutii tampon (ex.: citrat tampon pH 6.0 sau EDTA pH 9.0) folosind un cuptor cu microunde, baia de apa sau oala sub presiune;
• metoda enzimatica: utilizarea enzimelor precum proteinaza K sau tripsina.

Blocarea nespecifica

Pentru a reduce legarea nespecifica a anticorpilor, se aplica o solutie blocanta (de exemplu, ser normal, albumina bovina sau peroxidaza) pe sectiunile de tesut.

Aplicarea anticorpului primar

Se utilizeaza un anticorp primar specific pentru antigenul tinta. Acest anticorp este aplicat pe sectiunea de tesut si incubat pentru o anumita perioada (de obicei 30 de minute pana la cateva ore, in functie de specificitatea si sensibilitatea testului).

Aplicarea anticorpului secundar

Daca anticorpul primar nu este conjugat cu un marker, se utilizeaza un anticorp secundar, care recunoaste anticorpul primar. Anticorpul secundar este, de obicei, conjugat cu o enzima (ex.: peroxidaza de hrean - HRP sau fosfataza alcalina - AP) sau un fluorocrom.

Detectia semnalului

In cazul in care anticorpul secundar este conjugat cu o enzima, se aplica un substrat cromogen (ex.: DAB - diaminobenzidina) care produce o reactie colorata vizibila la microscop.

Daca anticorpul este conjugat cu un fluorocrom, se utilizeaza un microscop de fluorescenta pentru a vizualiza semnalul.

Contracolorarea

Sectiunile sunt contracolorate pentru a evidentia structurile celulare generale. De exemplu, hematoxilina coloreaza nucleii celulari in albastru. Dupa contracolorare, sectiunile sunt clatite, deshidratate si montate cu un mediu adecvat pentru microscopie.

Interpretarea rezultatelor

Sectiunile colorate sunt examinate la microscop optic sau de fluorescenta. Rezultatul poate fi exprimat in termeni calitativi (pozitiv/negativ) sau semiquantitativi (intensitatea semnalului si procentul celulelor pozitive).

Controlul calitatii

Pentru a valida rezultatele, se includ controale pozitive si negative:

• control pozitiv: un tesut despre care se stie ca exprima antigenul tinta;
• control negativ: o sectiune tratata fara anticorp primar, pentru a exclude reactiile nespecifice.

Avantaje ale testelor de imunohistochimie

Testele de imunohistochimie (IHC) prezinta mai multe avantaje (2), (3), atat in cercetare, cat si in diagnosticul medical. Printre cele mai importante avantaje se numara:

• specificitate ridicata - utilizarea anticorpilor specifici permite detectarea precisa a proteinelor tinta, reducand riscul de rezultate false;
• localizarea precisa a antigenului - IHC permite identificarea exacta a distributiei proteinei in tesut, oferind informatii despre localizarea intracelulara (ex. nucleu, citoplasma, membrana);
• valoare diagnostica ridicata - este esential in diagnosticul cancerelor, permitand identificarea markerilor specifici (ex. HER2 in cancerul de san, Ki-67 pentru rata de proliferare);
• compatibilitate cu alte tehnici - rezultatele IHC pot fi integrate cu alte metode, cum ar fi analiza moleculara sau tehnicile de microscopie avansata;
• timp relativ scurt de analiza - fata de alte metode moleculare, cum ar fi secventierea ADN, IHC poate oferi rezultate rapide;
• conservarea structurii tesutului - permite analiza antigenilor in contextul arhitecturii tisulare, ceea ce este esential pentru intelegerea interactiunilor celulare si structurale;
• utilizare in medicina personalizata - ajuta la selectarea tratamentelor tintite, bazate pe markerii moleculari specifici pacientului.

Limitari ale testelor de imunohistochimie